Клонирование организмов. Клонирование человека Клонами являются искусственно выращенные организмы
О. В. САБЛИНА,
кандидат биологических наук, СУНЦ НГУ
КЛОНИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ
Пожалуй, ни одно из достижений биологической науки не вызывало такого накала страстей в обществе, как клонирование млекопитающих. Если некоторые люди, как биологи, так и не имеющие отношения к «Life Sciences» (наукам о жизни), с восторгом приняли появившуюся, хотя бы и теоретически, возможность клонирования человека и готовы завтра же клонироваться, то большинство неспециалистов отнеслись к такой возможности, мягко говоря, очень настороженно.
Бурные дебаты в средствах массовой информации привели к тому, что среди населения оказалось распространенным мнение о крайней опасности подобных исследований. Этому немало способствовали «клоны», «заселившие» художественную литературу и кино. Несколько лет назад одна из околонаучных группировок заявила о намерении клонировать Гитлера, для того чтобы его повесить за совершенные преступления. Это, в свою очередь, породило опасения, что диктаторы типа Гитлера могут увековечить свою власть, передав ее своим клонам. В большинстве подобных представлений клоны человека - «ненастоящие люди», тупые и злобные, а клонированные животные и растения угрожают погубить всю биосферу. Здесь следует особо отметить, что люди нередко путают клонирование и трансгенез, тогда как это абсолютно разные вещи. Действительно, при получении трансгенных многоклеточных животных применяют клонирование, однако в этом случае клонирование - не цель, а средство. Клонирование без транс-генеза - прием, широко используемый в самых разных по своим целям проектах.
Насколько обоснованы эти страхи и надежды? Представляется очень важным формирование спокойного взвешенного суждения относительно перспектив и возможных последствий этих исследований. Для этого нужно ответить на несколько основных вопросов, что мы и попытаемся сделать.
Итак, что же такое клонирование? Как клонируют животных? Почему ученые этим занимаются? Для чего можно использовать технику клонирования животных? Допустимо ли клонирование человека?
ЧТО ТАКОЕ КЛОН?
Греческое слово κλ w n
означает побег, отросток. Сейчас клонами называются особи животных или растений, полученные путем бесполого размножения и имеющие полностью идентичные генотипы. Клоны очень широко распространены среди растений - все сорта вегетативно размножаемых культурных растений (картофель, плодовые и ягодные растения, гладиолусы, тюльпаны и т.д.) являются клонами. Разработанная в настоящее время техника микроклонального размножения позволяет получать за короткое время огромное количество генетически идентичных экземпляров даже таких растений, которые в естественных условиях вегетативно не размножаются.У животных такой тип размножения распространен значительно меньше. Тем не менее известно более 10 ООО видов многоклеточных животных, размножающихся путем деления одного организма на два или даже несколько частей (аутофрагмен-тация), которые вырастают в полноценные организмы. Эти новые организмы также являются клонами. Естественные клоны, возникающие путем обособления части клеток организма и развития из них полноценной особи, характерны не только для таких примитивных животных, как губки или хрестоматийные гидры. Даже такие достаточно высоко организованные животные, как морские звезды и черви, могут размножаться делением. Но позвоночные или насекомые такой способности лишены. Тем не менее клоны, возникшие естественным путем, встречаются даже у млекопитающих.
Природными клонами являются так называемые монозиготные близнецы, которые происходят из одной оплодотворенной яйцеклетки. Это происходит, когда зародыш на самых ранних стадиях дробления разделяется на отдельные бластомеры и из каждого бластомера развивается самостоятельный организм. Например, у американского девятиполосного броненосца всегда рождается по четыре монозиготных близнеца. Разделение зародыша на стадии четырех бластомеров на самостоятельные зародыши - нормальное явление для этого млекопитающего.
Такие близнецы представляют собой как бы обособившиеся части одного организма и имеют один и тот же генотип, т. е. являются клонами.
Монозиготные (или идентичные) близнецы у человека также являются клонами. Наибольшее известное число родившихся монозиготных близнецов у человека равняется пяти. Вероятность рождения близнецов у человека невелика - среди белого населения Европы и Северной Америки она в среднем составляет около 1%. Реже всего близнецы рождаются в Японии. В африканском племени йоруба частота близнецов составляет 4,5% всех рождений, а в некоторых районах Бразилии - до 10%, однако только незначительная часть из них являются монозиготными. Существуют и семьи с генетической предрасположенностью к рождению близнецов, но тоже только дизиготных.
Одновременная овуляция обусловлена определенным сбоем в работе гормональной системы, который может иметь генетическую природу. Причина же, по которой происходят разделение зародыша и образование монозиготных близнецов у человека, неизвестна. Частота этого явления - около 0,3% во всех популяциях человека.
Очень редко случается, что по неизвестной причине зародыш разделяется не до конца. Тогда рождаются сросшиеся (вернее, недоразделившиеся), так называемые сиамские близнецы. Примерно четверть всех идентичных близнецов являются «зеркальными», например, один из близнецов левша, другой правша, у одного волосы на макушке закручены по часовой стрелке, у другого против, у одного сердце расположено слева, а печень справа, у другого - наоборот. Ученые считают, что «зеркальность» близнецов является следствием разделения эмбриона на достаточно поздней стадии развития.
Таким образом, клоны животных и человека - нормальное природное явление. Этот факт сразу позволяет ответить на некоторые вопросы в связи с клонированием человека: клоны - абсолютно нормальные, полноценные люди, отличающиеся от всех остальных людей только тем, что имеют генетического двойника. Они являются самостоятельными, автономными организмами, хотя и имеющими идентичные генотипы. Поэтому любые надежды достичь бессмертия путем клонирования абсолютно беспочвенны. По этой же причине клоны не могут нести никакой ответственности за поступки, совершенные их «генетическим оригиналом».
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ
Клонированием называют искусственное получение клонов животных (в случае клонирования растений чаще пользуются терминами «вегетативное размножение», «меристемная культура»). Поскольку высшие животные не могут размножаться вегетативно, то для получения клона можно в принципе воспользоваться тремя методами:
удвоить набор хромосом в неоплодот-воренной яйцеклетке, получив таким образом
диплоидную яйцеклетку, и заставить ее развиваться без оплодотворения;
искусственно получить монозиготных близнецов, разделив начавший развиваться
эмбрион;
удалить ядро из яйцеклетки, заменив его на диплоидное ядро соматической клетки,
и тоже заставить развиваться такую «зиготу».
Все эти три возможности ученые использовали для клонирования животных.
Первый способ удается применить не для всех животных. Еще в 30-е гг. XX в. Б.Л. Астаурову удалось с помощью термического воздействия активировать неопло-дотворенное яйцо тутового шелкопряда к* развитию, блокировав при этом прохождение первого деления мейоза. Естественно, ядро при этом оставалось диплоидным. Развитие такой диплоидной яйцеклетки заканчивалось вылуплением личинок, точно повторяющих генотип матери. Естественно, при этом получались только самки. К сожалению, разводить самок экономически невыгодно, так как при большей затрате корма они дают коконы худшего качества. В.А. Струнников усовершенствовал этот метод, разработав способ получения клонов тутового шелкопряда, состоящих только из особей мужского пола. Для этого на ядро яйцеклетки воздействовали гамма-лучами и высокой температурой. Это делало ядра, не способными к оплодотворению. Ядро сперматозоида, проникшего в такое яйцо, удваивалось и приступало к делению. Это приводило к развитию самца, повторявшего генотип отца. Правда, полученные клоны для промышленного шелководства непригодны, но их используют в селекции для получения эффекта гетерозиса. Это позволяет резко ускорить и облегчить получение выдающегося по продуктивности потомства. Сейчас эти методы широко применяются в шелководстве в Китае и Узбекистане.
К сожалению, успех с тутовым шелкопрядом является исключением - у других животных получить клоны таким способом не удается. Исследователи пробовали удалить один из пронуклеусов из оплодотворенной яйцеклетки и удваивали число хромосом другого, обрабатывая их веществами, разрушающими микротрубочки веретена деления. Получались диплоидные клетки, гомозиготные по всем генам (содержащие либо два материнских, либо два отцовских генома). Такие зиготы начинали дробиться, однако развитие прекращалось на ранней стадии и получить таким способом клоны млекопитающих оказалось невозможно. Были сделаны попытки пересадить пронуклеусы из одной оплодотворенной яйцеклетки в другую. Оказалось, что полученные таким способом зародыши развивались нормально только в том случае, если один пронуклеус представлял собой ядро яйцеклетки, а другой - сперматозоида. Эти эксперименты показали, что для нормального развития эмбрионов млекопитающих необходимы два разных генома - материнский и отцовский. Дело в том, что при формировании половых клеток имеет место геномный импринтинг - метилирование участков ДНК, что приводит к выключению метилированных генов. Это выключение остается на всю жизнь. Поскольку в мужских и в женских половых клетках выключаются разные гены, то для нормального развития организма нужны оба генома - одна работающая копия гена должна быть.
Второй метод - разделение эмбриона на ранних стадиях дробления в эмбриологии используют очень давно, правда в основном на морских ежах и лягушках. Именно таким способом были получены данные о способности выделенных из зародыша бластоме-ров дать начало полноценному организму. Клоны-монозиготные близнецы млекопитающих были получены существенно позже, но искусственное разделение эмбрионов и последующая их имплантация «суррогатным матерям» уже применяются в селекции сельскохозяйственных животных для получения большого числа потомков от особо ценных родителей. В 1999 г. таким способом была клонирована обезьяна. Оплодотворение было проведено в пробирке. Зародыш на стадии восьми клеток был разделен на четыре части, и каждая двуклеточная часть была имплантирована в матку другой обезьяны. Три зародыша при этом развиваться не стали, а из четвертого родилась обезьянка, которую назвали Тетра (Четвертинка).
Самое знаменитое клонированное животное, овечка Долли, была клонирована с помощью
третьего метода - переноса генетического материала соматической клетки в яйцеклетку,
лишенную собственного ядра.
Метод пересадки ядер был разработан еще в 40-х гг. XX в. русским эмбриологом
Г.В. Лопашовым, работавшим с яйцеклетками лягушки. Правда, взрослых лягушек он
не получил. Позднее англичанину Дж. Гёрдону удалось заставить яйцеклетки лягушки
с чужим ядром развиваться до получения взрослых особей. Это было выдающееся достижение
- ведь он пересаживал в яйцеклетку ядра дифференцированных клеток взрослого организма.
Он использовал клетки плавательной перепонки и клетки эпителия кишечника. Но и
у него до взрослого состояния развивалось не более 2% таких яйцеклеток, причем
выросшие из них лягушки отличались меньшими размерами и пониженной жизнеспособностью
по сравнению с их нормальными сверстниками.
Пересадить ядро в яйцеклетку млекопитающего значительно труднее, так как она примерно в 1000 раз мельче, чем яйцеклетка лягушки. В 1970-х гг. в нашей стране в Институте цитологии и генетики в Новосибирске на мышах это пытался сделать замечательный ученый Л.И. Корочкин. К сожалению, его работы не получили продолжения из-за трудностей с финансированием. Зарубежные ученые продолжали исследования, однако операция трансплантации ядра оказалась слишком травматичной для мышиных яйцеклеток. Поэтому экспериментаторы пошли другим путем - стали просто проводить слияние яйцеклетки, лишенной собственного ядра, с целой неповрежденной соматической клеткой.
Группа исследователей из Рослинско-го института в Шотландии, возглавляемая Я. Вилмутом, клонировавшие Долли, использовали для слияния клеток электрический импульс. Они удаляли ядра из зрелых яйцеклеток, затем с помощью микропипетки вводили под оболочку яйцеклетки соматическую клетку, выделенную из молочной железы овцы. С помощью электрического удара клетки сливались и в них стимулировалось деление. Затем, после культивирования в течение 6 дней в искусственных условиях, начавший развиваться эмбрион на стадии морулы имплантировали в матку специально подготовленной овцы другой породы (хорошо отличавшейся фенотипически от донора генетического материала). Рождение овечки Долли стало громкой сенсацией, а у некоторых ученых возникли сомнения в том, что она действительно была клоном. Однако специальные проведенные исследования ДНК показали, что Долли - настоящий клон.
В дальнейшем техника клонирования млекопитающих была усовершенствована. Группе ученых из университета Гонолулу под руководством Риузо Янагимачи удалось с помощью изобретенной ими микропипетки осуществить перенесение ядра соматической клетки непосредственно в яйцеклетку. Это позволило им обойтись без электрического импульса, который был далеко небезопасен для живых клеток. Кроме того, они использовали менее дифференцированные клетки - это были клетки кумулуса (соматических клеток, окружающих яйцеклетку и сопровождающих ее во время движения по яйцеводу). К настоящему времени этим методом клонированы и другие млекопитающие - корова, свинья, мышь, кошка, собака, лошадь, мул, обезьяна.
ЗАЧЕМ КЛОНИРОВАТЬ ЖИВОТНЫХ?
Несмотря на огромные успехи, клонирование млекопитающих остается сложной и дорогостоящей процедурой. Почему же ученые не оставляют эти эксперименты? Прежде всего потому, что это... интересно. Причем не просто любопытно - получится или нет, уже ясно, что получится. Клонирование млекопитающих чрезвычайно важно для фундаментальной науки. Это уникальный инструмент, позволяющий исследовать один из самых сложных и интригующих вопросов биологии - как, какими путями информация, записанная последовательностью нуклеотидов в ДНК, реализуется во взрослом неповторимом организме, каким образом осуществляется точнейшее взаимодействие тысяч генов, каждый из которых «включается» и «выключается» именно в то время и в той клетке, где это необходимо. Известно, что некоторые гены, работающие на самых ранних этапах эмбриогенеза, в ходе дальнейшего развития и дифферен-цировки клеток необратимо выключаются.
Как это происходит? Можно ли заставить дифференцированную клетку претерпеть обратную дифференцировку? На последний вопрос без клонирования ответить вообще невозможно. Сам факт, что клонирование млекопитающих удается, вроде бы говорит о том, что обратная дифференцировка возможна. Однако не все так просто. Часто животные клонированы из недифференцированных - эмбриональных стволовых клеток или из клеток кумулуса. В других случаях, возможно, также были использованы стволовые клетки. В частности, овечка Долли была клонирована из клетки молочной железы беременной овцы, а при беременности под действием гормонов стволовые клетки молочной железы начинают размножаться, так что вероятность того, что экспериментаторы возьмут именно стволовую клетку, повышается. Предполагают, что именно так и было с Долли. Этим может объясняться и очень малая эффективность клонирования - ведь стволовых клеток в ткани немного.
Но, конечно, если бы у метода клонирования не было хорошо просматриваемых практических выходов, исследования не были бы столь интенсивными. Какая же практическая польза может быть от клонированных животных? В первую очередь, клонирование высокопродуктивных домашних животных может быть использовано для получения в короткий срок больших количеств элитных коров, ценных пушных зверей, спортивных лошадей и т.д. Некоторые ученые считают, что клонирование никогда не будет широко применяться в животноводстве из-за того, что эта процедура весьма дорогая. Кроме того, условием селекции всегда было генетическое разнообразие, клонирование же, тиражируя один генотип, сужает это разнообразие. Тем не менее поскольку половое размножение необходимо связано с рекомбинацией, разрушающей сочетания аллелей, клонирование может помочь сохранить уникальные генотипы. Клонирование путем разделения начавших дробиться эмбрионов уже сейчас используется в селекции крупного рогатого скота.
Особые надежды ученые возлагают на клонирование диких животных, которым грозит
исчезновение. Уже в настоящее время создаются «Замороженные Зоопарки» - образцы
клеток таких животных, хранящиеся в замороженном виде при температуре жидкого
азота (-196°С). В Америке уже родились два детеныша дикого быка бантенга, клонированные
из клеток животного, умершего в 1980 г. Его клетки были заморожены и более 20
лет хранились в жидком азоте. Клонированы также другой вид дикого быка гаур, европейский
дикий баран, дикие африканские степные кошки.
Клонирование кошек - особо интересный и важный эксперимент, проведенный в Институте
Природы в городе Одюбоне (США). Там были получены два клона-самки от одной кошки-донора
и один клон-самец от кота по имени Джаз. Джаз, в свою очередь, был выращен из
эмбриона, который в течение 20 лет хранился в замороженном состоянии в жидком
азоте, а потом был выношен и рожден обычной домашней кошкой. В 2005 г. обе кошки-клоны
общими усилиями родили восьмерых котят. Отцом всех восьмерых был кот-клон Джаз.
Этот опыт показал, что клоны способны к нормальному размножению. Следует, однако,
понимать, что с помощью клонирования вряд ли удастся «воскресить» исчезнувший
вид. Тем не менее это может помочь сохранить генофонд, если использовать полученные
клоны в скрещиваниях с животными, содержащимися в зоопарках. Такое использование
клонов может помочь избежать негативных последствий близкородственного скрещивания,
неизбежного при малой численности вида.
Здесь следует сказать и о надеждах клонировать уже исчезнувших животных - мамонта, тасманийского сумчатого волка, зебры квагги. Оптимисты предполагают, что можно использовать ДНК этих животных, сохранившуюся либо в вечной мерзлоте, либо в законсервированных тканях. Однако предпринятая попытка клонировать тасманийского сумчатого волка, последнийэкземпляр которого погиб в зоопарке в 1936 г., не удалась. Это и неудивительно, так как в распоряжении ученых не было живых клеток, а только образцы тканей, хранившиеся в спирте. Из них была выделена ДНК, но она оказалась слишком поврежденной, да и существующие в настоящее время методы не позволяют клонировать животных») не имея достаточного количества живых клеток. По этой же причине мала вероятность когда-либо клонировать мамонта. Во всяком случае, все предпринятые попытки культивировать клетки мамонта, пролежавшие тысячелетия в вечной мерзлоте, оказались безуспешными. Кроме того, следует иметь в виду, что если даже и удалось бы получить и вырастить один клон мамонта или квагги, это не было бы воскрешением вида. Из одного или даже из нескольких экземпляров получить вид нельзя. Считается, что для устойчивого существования и воспроизведения вида необходимо по крайней мере несколько сотен особей. Поэтому ископаемая ДНК или ДНК из хранящихся в спирте тканей достаточна для анализа или даже для трансгенеза, но недостаточна для клонирования. Хотя известны случаи выживания вида после катастрофического падения численности. Один из таких видов - гепард. Генетический анализ показывает, что в его истории был момент, когда его поголовье составляло 7-10 особей. Хотя гепарды и выжили, последствия близкородственного скрещивания остались - частое бесплодие, мертворождения и другие трудности с размножением. Другой такой вид - человек. В эволюционной истории человека было не менее двух эпизодов прохождения резкого падения численности вида, а для американских индейцев - даже больше (заселение Америки шло из Восточной Сибири по Берингийскому перешейку очень небольшими группами - 7-10 человек). Именно поэтому генетическое разнообразие человека невелико, следствием чего является разнообразие фенотипическое - многие гены находятся в гомозиготном состоянии.
Безусловно, незаменимым методом клонирование является для получения трансгенных животных. Хотя применяются и другие методы получения трансгенных животных, именно клонирование позволяет получать животных с заданными свойствами для практических нужд. В том же Рослинском институте в Эдинбурге, где родилась Долли, были получены и клонированные овечки Полли и Молли. Для их клонирования были использованы генетически измененные клетки, культивировавшиеся в искусственных условиях. Эти клетки, кроме обычных овечьих генов, несли человеческий ген IX фактора свертываемости крови.
Генетическая конструкция содержала промотор, экспрессирующийся в клетках молочной железы. Поэтому белок, кодируемый этим геном, выделялся с молоком. Полли была первым клонированным трансгенным млекопитающим. Ее рождение открыло новые перспективы в лечении некоторых заболеваний человека. Ведь многие болезни связаны с нехваткой определенного белка - фактора свертываемости или гормона. До сего времени такие лекарства можно было получать только из донорской крови. А ведь количество гормона в крови очень мало! Кроме того, использование препаратов крови чревато инфекционными заболеваниями - не только СПИДом, но и вирусными гепатитами, которые не менее опасны. А трансгенных животных можно тщательно отобрать и проверить, содержать их на чистейших альпийских пастбищах. Ученые подсчитали, что для того чтобы обеспечить лекарственным белком всех (!) больных гемофилией на Земле, потребуется не слишком большое стадо трансгенных животных - 35-40 коров. При этом провести трансгенез и клонирование нужно-то всего только двух животных - самки и самца, а они, размножаясь естественным путем, передадут нужный ген потомству. При этом, поскольку у самцов ген в молочной железе не работает вообще, а у самок работает только во время лактации и продукт сразу же выводится с молоком из организма, никаких неудобств или нежелательных последствий для животных этот чужой ген не представляет. Сейчас используют в качестве таких биореакторов овец, коз, кроликов и даже мышей. Правда, коровы дают существенно больше молока, но и размножаются они гораздо медленнее и лактировать начинают позже. Есть и другие возможности использования трансгенных клонов и в научных, и в практических целях, но здесь мы это рассматривать не будем.
ТРУДНОСТИ И ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ КЛОНИРОВАНИИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Несмотря на впечатляющие успехи, пока нельзя утверждать, что клонирование стало
обычной лабораторной методикой. Это по-прежнему очень сложная процедура, не слишком
часто приводящая к ожидаемому результату. Какие же трудности возникают при клонировании
животных?
В первую очередь, это низкая эффективность клонирования. Процедуры, применяемые
при клонировании млекопитающих, являются весьма травмирующими для клеток. Далеко
не всем клеткам удается их благополучно пережить. Не все начавшие развиваться
эмбрионы доживают до рождения. Так, чтобы получить Долли, пришлось для выделения
яйцеклеток прооперировать 40 овец (см. рис. 5). Из 430 яйцеклеток удалось получить
277 диплоидных «зигот», из которых только 29 начали развиваться и были имплантированы
«суррогатным» матерям. Из них дожил до рождения всего один эмбрион - Долли. Для
получения клонированной лошадки Прометеи было «сконструировано» около 840 эмбрионов, из них только 17 развились до того, чтобы
их можно было имплантировать «матерям». Четыре из них стали развиваться, но до
рождения дожила только одна Прометея.
Другой серьезной проблемой является здоровье родившихся клонов. Как правило, когда сообщается о рождении очередного клона, подчеркивается его отменное здоровье. Действительно, многие клонированные животные, вполне здоровые при рождении, доживали до взрослого состояния и рождали нормальных детенышей. Однако потом у них проявлялись нарушения со стороны разных систем органов. Так, Долли родилась здоровой и родила нескольких здоровых ягнят, но потом начала стремительно стареть и прожила вдвое меньше, чем обычная овца. Трансгенные Полли и Молли, также клонированные в Рослинском институте, прожили еще меньше. Успешно размножились клонированные степные кошки. Правда, о продолжительности их жизни данных пока нет. А вот бычок гаур, также производивший при рождении впечатление здорового, прожил всего два дня из-за кишечного заболевания. Вопрос о здоровье клонов еще нельзя считать окончательно решенным - результаты разных исследователей противоречивы. По некоторым данным очень многие клоны обладают слабым иммунитетом, подвержены простудным и желудочно-кишечным заболеваниям и стареют в 2-3 раза быстрее своих генетических родителей. Исследования японских ученых показали, что у клонированных мышей серьезно нарушено функционирование примерно 4% генов.
Но, пожалуй, самым обескураживающим оказалось то, что клоны могут довольно сильно отличаться от оригинала. Еще В.А. Струнниковым на тутовом шелкопряде было установлено, что, несмотря на одинаковые генотипы, члены одного клона оказываются непохожими по целому ряду признаков. В некоторых клонах это разнообразие оказалось даже большим, чем в обычных, генетически разнородных, популяциях. Несколько лет назад в США родилась очередная клонированная кошечка, которую назвали Сиси (Сс, CopyCat). Генетической мамой ее была трехцветная кошка Рэйн-боу (Радуга). Сиси оказалась непохожей на маму - двухцветной. Но анализ ДНК показал, что она действительно является клоном Радуги. Различия связаны с тем, что ген рыжей окраски находится в Х-хромосоме. У самок одна из Х-хромосом оказывается инактивированной в раннем эмбриогенезе. Инактивируются Х-хромосомы случайно, состояние инактивированности в клетке и клетках-потомках сохраняется на всю жизнь. У гетерозиготной кошки рыжими оказываются те клетки, где инактивирована «нерыжая» Х-хромосома. Клон был получен из одной соматической клетки, в которой одна из Х-хромосом уже была инактивирована. У Сиси инактивированной оказалась «рыжая» Х-хромосома. У млекопитающих в Х-хромосоме находится около 5% всех генов, и клоны могут оказаться непохожими друг на друга по достаточно большому числу признаков. Кстати, такое явление известно и для природных клонов - монозиготных близнецов. Были описаны две сестры - монозиготные близнецы, одна из которых была здорова, а у другой была гемофилия. Известно, что у женщин гемофилия бывает крайне редко, только в случае гомозиготное™. У гетерозигот примерно половина «здоровых» Х-хромосом инактивирована, но оставшейся половины достаточно для нормальной свертываемости крови. Упомянутые близнецы, по-виДимому, возникли в результате разделения эмбриона на стадии, когда Х-хромосомы уже были инакти-вированы и у одной из сестер нормальная хромосома оказалась инактивированной во всех клетках организма. Результатом стало развитие заболевания у гетерозиготы.
Могут быть и другие причины непохожести клонов. Все искусственно полученные клонированные эмбрионы развиваются не в таких условиях, как оригинал. Другими являются возраст суррогатной матери, её гормональный статус, питание и т. п. А эти факторы очень важны во время эмбриогенеза. Причинами различий клона и оригинала могут быть и вариации фенотипического проявления генов (экспрессивность и пенетрантность), различия в геноме митохондрий (клоны имеют не такие митохондрии, как оригинал), отличия в рисунке инактивации (импринтинг) некоторых генов в эмбриогенезе, неустранимые различия ядер соматических и половых клеток (например, неполная дедифференцировка ядра соматической клетки, помещенного в яйцеклетку).
ПРОБЛЕМА КЛОНИРОВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА
Именно возможность искусственного клонирования человека вызвала бурные эмоции в обществе. Количество самых полярных высказываний (диапазон их от «к концу следующего столетия население планеты будет состоять из клонов» до «какой-то фантастический роман, интересный, но абсолютно нереалистичный») не поддается исчислению. Некоторые люди уже завещают сохранить их клетки в состоянии глубокого замораживания для того, чтобы, когда техника клонирования будет отработана, воскреснуть в виде клона, обеспечив тем самым себе бессмертие. Другие думают путем клонирования преодолеть бесплодие или вырастить себе «запасные части» - органы для трансплантации. Третьи хотят облагодетельствовать человечество, населив его клонами гениев. Насколько оправданы эти оценки и чаяния? Попробуем спокойно, «без гнева и пристрастья» ответить на некоторые вопросы, возникающие в связи с понятием «клонирование человека».
Вопрос первый: возможно ли клонирование человека? Ответ однозначен: да, конечно, технически это возможно.
Вопрос второй: зачем клонировать человека? Ответов несколько, разной степени реалистичности:
1. Достижение личного бессмертия. Эту перспективу можно серьезно не обсуждать,
об абсурдности этих надежд было сказано выше.
2. Выращивание гениальных личностей. Главное сомнение - а будут ли они гениальными?
Слишком сложный это признак, и, хотя генетическая составляющая в его формировании
не вызывает сомнения, величина этой составляющей может варьировать, а влияние
средовых факторов может быть велико и непредсказуемо. И - важный вопрос - будут
ли они благодарны тем, кто создал их двойников, нарушив естественное право человека
на собственную неповторимость? Ведь и у монозиготных близнецов иногда возникают
проблемы, связанные именно с этим аспектом.
3. Научные исследования. Сомнительно, чтобы существовали такие научные проблемы,
которые можно было бы разрешить исключительно только с помощью клонов человека
(об этических аспектах этого - чуть позже).
4. Использование клонирования в медицинских целях. Это именно тот вопрос, который
следует обсуждать серьезно.
Предполагается, что можно использовать клонирование для преодоления бесплодия - это так называемое репродуктивное клонирование. Бесплодие, действительно, является чрезвычайно важной проблемой, многие бездетные семьи согласны на самые дорогие процедуры, чтобы иметь возможность родить ребенка.
Но возникает вопрос - а что принципиально нового может дать клонирование по сравнению, например, с экстракорпоральным оплодотворением с использованием донорских половых клеток? Честный ответ будет - ничего. Клонированный ребенок не будет иметь генотипа, являющего комбинацией генотипов мужа и жены. Генетически такая девочка будет монозиготной сестрой своей матери, генов отца у нее не будет. Точно так же клонированный мальчик для своей матери будет генетически чужд. Другими словами, получить генетически полностью «своего» ребенка с помощью клонирования бездетная семья не сможет, так же как и при использовании донорских половых клеток («дети из пробирки», полученные с помощью собственных половых клеток мужа и жены, генетически не отличаются от «обычных» детей). А в таком случае - зачем такая сложная и, что особенно важно, очень рискованная процедура? А если вспомнить, какова эффективность клонирования, представить себе, сколько нужно получить яйцеклеток, чтобы родился один клон, который к тому же, возможно, будет больным, с укороченной продолжительностью жизни, сколько эмбрионов, уже начавших жить, погибнет, то перспектива репродуктивного клонирования человека становится устрашающей. В большинстве тех стран, где технически возможно осуществление клонирования человека, репродуктивное клонирование законодательно запрещено.
Терапевтическое клонирование предполагает получение эмбриона, выращивание его до 14-дневного возраста, а затем использование эмбриональных стволовых клеток в лечебных целях. Перспективы лечения с помощью стволовых клеток ошеломляющи - излечение многих нейродегене-ративных заболеваний (например болезней Альцгеймера, Паркинсона), восстановление утраченных органов, а при клонировании трансгенных клеток - лечение многих наследственных болезней. Но посмотрим правде в лицо: фактически это означает вырастить себе братика или сестричку, а потом - убить, чтобы использовать их клетки в качестве лекарства. И если убивается не новорожденный младенец, а двухнедельный эмбрион, дела это не меняет. И, хотя, ограниченное использование терапевтического клонирования в большинстве стран не запрещено, очевидно, что человечество вряд ли пойдет по этому пути. Поэтому ученые ищут другие пути для получения стволовых клеток.
Китайские ученые с целью получения эмбриональных стволовых клеток человека создали гибридные эмбрионы путем клонирования ядер клеток кожи человека в яйцеклетках кроликов. Было получено более 100 таких эмбрионов, которые в течение нескольких дней развивались в искусственных условиях, а затем из них были получены стволовые клетки. Неизбежно возникает вопрос, что получилось бы, если такой эмбрион имплантировали бы в матку суррогатной матери и дали ему возможность развиваться. Эксперименты с другими видами животных дают основания считать, что жизнеспособный плод вряд ли бы мог развиться. Ученые надеются, что такой способ получения стволовых клеток окажется этически более приемлемым, чем клонирование человеческих эмбрионов.
Но, к счастью, оказывается, что эмбриональные стволовые клетки можно получать гораздо проще, не прибегая к сомнительным с этической точки зрения манипуляциям. У каждого новорожденного в его собственной пуповинной крови содержится довольно много стволовых клеток. Если эти клетки выделить, а затем хранить в замороженном виде, их можно будет использовать, если возникнет такая необходимость. Создавать такие банки стволовых клеток можно уже сейчас. Правда, следует иметь в виду, что стволовые клетки еще могут преподнести сюрпризы, в том числе и неприятные. В частности, есть данные о том, что стволовые клетки могут легко приобретать свойства злокачественности. Скорее всего, это связано с тем, что в искусственных условиях они изъяты из-под жесткого контроля со стороны организма. А ведь контроль «социального поведения» клеток в организме не только жесткий, но весьма сложный и многоуровневый. Но, конечно, возможности использования стволовых клеток столь впечатляющи, что исследования в этой области и поиски доступного источника стволовых клеток будут продолжаться.
И наконец, последний вопрос: допустимо ли клонирование человека?
Конечно, клонирование человека, безусловно, недопустимо, пока не преодолены технические
сложности и низкая эффективность клонирования, пока не гарантирована нормальная
жизнеспособность клонов. Несмотря на то, что время от времени появляются сообщения
о том, что где-то родились клонированные дети, до настоящего времени ни одного
документированного, достоверного случая успешного клонирования человека нет. Сенсационное
сообщение о клонировании человеческих эмбрионов с очень высокой эффективностью
южнокорейским ученым Ву-Сук Хваном не подтвердилось, были получены доказательства
фальсификации результатов. До того чтобы клонирование стало обычной безопасной
процедурой, еще очень далеко. Смысл вопроса в другом - допустимо ли клонирование
человека в принципе? Какие последствия могло бы иметь применение этого способа
размножения?
Одним из вполне реальных последствий клонирования может стать нарушение соотношения полов в потомстве. Не секрет, что очень и очень многие семьи во многих странах хотели бы иметь скорее мальчика, чем девочку. Уже в настоящее время в Китае возможность пренатальной диагностики пола и меры по ограничению рождаемости привели к такому положению, что в некоторых районах среди детей наблюдается значительное преобладание мальчиков. Что будут делать эти мальчики, когда придет время заводить семью?
Другое негативное следствие широкого применения клонирования - снижение генетического разнообразия человека. Оно и так невелико - существенно меньше, чем, например, даже у таких малочисленных видов, как человекообразные обезьяны. Причина этого - резкое снижение численности вида, имевшее место не менее двух раз за последние 200 тыс. лет. Следствием является большое количество наследственных заболеваний и дефектов, вызываемых переходом мутантных аллелей в гомозиготное состояние. Дальнейшее снижение разнообразия может поставить под угрозу существование человека как вида. Правда, справедливости ради следует сказать, что столь широкого распространения клонирования вряд ли следует ожидать даже в отдаленном будущем.
И наконец, не следует забывать о тех последствиях, которые мы пока не в состоянии предусмотреть.
В заключение нужно сказать вот о чем. Стремительное развитие биологии и медицины поставило перед человеком множество новых вопросов, которые никогда раньше не возникали и не могли возникнуть - допустимость клонирования или эвтаназии; возможности реанимации поставили вопрос о границе жизни и смерти; угроза перенаселения Земли требует ограничения рождаемости. С подобными проблемами человечество никогда не сталкивалось и поэтому не выработало никаких этических установок по их поводу. Именно поэтому сейчас невозможно дать ясные и четкие ответы, что можно, а что нельзя. Нужно отдавать себе отчет и вот еще в чем: можно законодательно запретить те или иные работы, но природа человека такова, что, если что-нибудь (клонирование человека, например) технически возможно, оно рано или поздно будет сделано несмотря ни на какие запреты. Именно поэтому необходимо широкое обсуждение подобных вопросов, с тем чтобы вырабатывалось осознанное отношение к таким проблемам, по которым в настоящее время невозможно дать однозначного ответа.
"Биология для школьников" . - 2014 . - № 1 . - С. 18-29.
Клонирование - это, методы получения нескольких идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения. В наши дни термин “клонирование” как правило используется в более узком смысле и означает копирование клеток, генов, антител и даже многоклеточных организмов в лабораторных условиях. Экземпляры которые появились в результате бесполого размножения по определению генетически одинаковые, но и у них можно наблюдать наследственную изменчивость, которая обусловлена случайными мутациями или создаваемую искусственно в лаборатории.
Что такое клон?
По научному клон (от греческого klon - ветвь, отросток) - «это ряд следующих друг за другом поколений наследственно однородных потомков одной исходной особи (растение, животное, микроорганизм), которые образуются в результате бесполого размножения». Классическим примером такой вегетации может послужить размножение амебы, клетка которой делится, а каждая из 2-х образовавшихся делится снова, образуя 4, и т. д. В основе методики клонирования лежит модель размножения, при которой внутри клетки происходит деление генетического материала.
Клон - не ксерокопия или двойник человека
Большинство людей толком и не представляют, как происходит сам процесс клонирования. Мало того, многие думают, что клон животного или человека это как ксерокопия: раз - и из лаборатории вышел ваш (или чей-то) готовый двойник.
Раз способом клонирования возможно копирование живых организмов, вегетативным (неполовым) путем выращивать клоны-копии живых существ, в том числе и млекопитающих, к классу которых относятся и люди, то клон человека, таким образом, - это просто идентичный близнец другого человека, отсроченный по времени. Скажем, для того чтобы получить клона человека в возрасте, к примеру, 40 лет, надо, чтобы прошли эти 40 лет.
Но научно-фантастические романы и фильмы создали у людей впечатление, словно человеческие клоны окажутся мрачными , монстрами. Это, конечно, не так.
Клоны людей будут обычными человеческими существами. Их станет вынашивать обычная женщина на протяжении 9-ти месяцев, они родятся и будут воспитываться в семье, как и любой другой ребенок. Клон-близнец будет на несколько десятилетий моложе своего оригинала, потому нет опасений, что люди могут их перепутать. Клон не сможет унаследовать ничего из воспоминаний оригинального индивида. То есть, клон - это не ксерокопия или двойник человека, а младший идентичный близнец. Ничего опасного в этом обстоятельстве нет.
Что ожидать от клонирования
Как было сказано выше, многие думают, что клонирование может привести к созданию людей-монстров или уродов. Но клонирование - это не генная инженерия, которая в действительности способна создавать монстров. Во время клонирования ДНК копируется, как результат появляется человек - точный близнец существующего индивида и, следовательно, не урод.
Что важно - у каждого клона, как бы там ни было, будет хотя бы один родитель - мать, выносившая и родившая его, и, как следствие, родившийся ребенок с юридической точки зрения ни чем не будет отличаться от других детей.
Теперь становится понятным, что ни сейчас, ни в скором будущем нашу планету не наводнят толпы клонов-гениев, нигде не появятся армии солдат-клонов, никто не сможет создать клонов-рабов, гаремы из клонов-наложниц и т. п.
Зачем нужно клонировать человека?
Тут имеются как минимум две веские причины: чтобы дать возможность семьям зачать детей - близнецов выдающихся личностей, и чтобы бездетные семьи могли иметь детей.
Ответ на первый взгляд простой, однако у самой проблемы имеется множество подводных камней. Казалось бы - почему не разрешить клонировать знаменитых ученых, представителей творческой интеллигенции, спорта? Стоило бы клонировать всех Нобелевских лауреатов ради того будущего вклада, который их близнецы смогли бы привнести в науку.
Но клон, к примеру, Альберта Энштейна, по факту, будет в любом случае являться родственником всех потомков великого ученого. И вот большой вопрос, как они могут отнестись к тому, что на свете появился их родственник, внешне как две капли воды похожий на их гениального предка, но при этом из-за разного воспитания, образования и прочего вдруг после 18-ти лет захочет стать не физиком, а скажем… сапожником! А ведь весь мир будет ждать от дубля Энштейна гениальных открытий.
Также и с другими выдающимися деятелями. Практически нельзя рассчитать, какое событие в жизни, к примеру, Махатмы Ганди или Жюля Верна подтолкнуло первого возглавить борьбу индийцев за независимость, а второго - стать известным писателем-провидцем.
Или еще похлеще - сбросятся, скажем, все поклонники , соберут деньги и заплатят за клонирование своего кумира, а новая секс-дива посмотрит вокруг и скажет: «Боже, в каком мрачном мире я родилась! Ухожу в монастырь». И все…
Следует заметить, по данным исследований службы Гэллапа, 9 из 10-ти американцев считают, что клонирование человека, если это в ближайшее время станет возможным, должно быть запрещено, а 2/3 американцев выступают против клонирования животных.
Мы живем в обществе, в котором мнение большинства может оказаться решающим, да еще ко всему это мнение можно легко сформировать при помощи современных PR-технологий. И тогда ребенок - клон выдающейся личности с самого детства станет заложником репутации своего давно умершего близнеца, а это уже прямое нарушение прав человека на целый ряд свобод.
Таким образом, единственно реальный и обусловленный довод в пользу клонирования - это желание родителей, потерявших своего ребенка, воссоздать, или, точней, возродить свое чадо.
И такого рода прецедент уже имеется - некая американская компания «Клонэйд» уже сейчас намеревается приступить к выполнению заказа одной семейной пары клонировать их умершую в 10-ти месячном возрасте дочь. Оплата предстоящей операции в сумме 560 тыс. долларов произведена, работы вроде бы уже ведутся. Со слов руководителя проекта, у компании имеется множество других заявок.
Клонирование и мнение церкви
Если с людскими законами вроде бы все в порядке, то вот закон Божий решительно против клонирования.
За запрет клонирования людей выступают представители практически всех мировых религий. Исследования ученых по клонированию живых существ и человека подрывают в сознании верующих идею Божественного творения всего сущего на Земле, оскорбляют личность и институт брака.
О непримиримой позиции Католической Церкви, которая насчитывает в мире больше миллиарда последователей, в отношении клонирования человеческих органов и самого человека, заявлял и Папа Римский Иоанн Павел II в своем выступлении еще в августе 2000 г. на Международном конгрессе специалистов по трансплантации в Риме.
Так что ученые, которые замахнулись на божественное, сильно рискуют. Как минимум - быть отлученными от церкви, а как максимум… Религиозных фанатиков много, и погромы в лабораториях - это еще не самое страшное, на что они способны.
«За» и «против»
Опытным путем удалось установить, что даже копирование ДНК не дает возможности получить идентичное живое существо. Так, к примеру, у клонированной кошки был другой окрас, чем у ее матери – донора генетического материала. Многие считали, что эта технология даст возможность «воскрешать» домашних любимцев, наиболее смелые надеялись даже воспроизводить умерших людей.
Рассматривать клонирование, как отрасль репродуктивной медицины, в наши дни никто не берется. А вот развивать ее потенциал в терапевтической области возможно. Если следовать исключительно таким путем, то количество противников клонирования резко уменьшается. Для этого можно рассмотреть все нюансы, затрагивающие процесс под названием клонирование.
«За» и «против» вкратце можно изложить так. К главным преимуществам относятся открывающуюся возможность лечения многих серьезных заболеваний, восстановления пострадавшей от ожогов кожи, замены органов. Однако противники настаивают на том, что надо не забывать о моральной и этической стороне вопроса, о том, что такие технологии призваны убивать зародившуюся жизнь (эмбрионы, из которых берутся стволовые клетки).
1997 год, 23 февраля в Великобритании, в лаборатории, под руководством ученого-генетика Яна Вильмута, после 277 неудачных опытов появилось «первое в мире искусственное млекопитающее» - овца Долли. Ее фотографии обошли почти все мировые газеты. Но, оказывается, еще в 1987 г. в одной российской лаборатории была искусственно создана мышь, получившая имя Маша.
Клонирование – это такой процесс, при котором генетически идентичная копия производится путем бесполого размножения. Этот термин обычно используется для обозначения искусственного клонирования человека. Есть два широко обсуждаемых типа человеческого клонирования: терапевтическое клонирование и репродуктивное клонирование.
Термин «клон» ввел в 1963 году Дж. Б. С. Холдейн, выдающийся шотландский биолог, в своей речи, озаглавленной «Биологические возможности для человека видами на ближайшие десять тысяч лет».
По заказу 57-летней американки Бернанн Маккини в южнокорейской клинике произвели клонирование собаки.
Историю клонирования человека можно проследить от 1880-х годов, когда ученые пытались доказать, как работает генетический материал в клетках.
Что генетический материал не теряется во время деления клетки продемонстрировал Ханс Dreisch на клонировании морских ежей, разделяя две клетки и выращивая их самостоятельно. В 1902 году Ганс Spemman повторяет тот же процесс на саламандрах.
Очень трудно проследить хронологию клонирования растений, из-за того, что такое клонирование растений тысячи лет практикуется как людьми, так и в самой природе.
Клонирования человека — За и Против
О клонировании человека, заговорили, когда шотландские ученые института Рослина создали знаменитую овцу Долли. Это вызвало во всем мире интерес и озабоченность.
Клонирование не так далеко от процедур, как экстракорпоральное оплодотворение, где оплодотворение яйцеклетки происходит в лаборатории и затем переносится в матку.
Экстракорпоральное оплодотворение, как правило, требует извлечения из множества клеток и может производиться несколько раз, чтобы сработать, если оно вообще сработает и даст результат. Это может также привести к многоплодной беременности.
Клонирование является лишь еще одной альтернативой для воспроизводства потомства и в отличие от ЭКО, оно занимает очень мало клеток и срабатывает с первого раза, что для беременности делает его более эффективным способом размножения.
Животные, в настоящее время клонированные, имеют генетически максимально желательные качества. Исследования также проводятся на клонирование исчезающих видов и мертвых животных.
В 2009 году представитель вымерших видов животных — Пиренейский буйвол был клонирован, однако, жил только в течение 7 минут, прежде чем стать вымершим еще раз.
Как происходит клонирование человека
Клонирование человека является производством генетической копии какого-то другого человека. Ядро, или центральная часть клетки, содержит большую часть своего генетического материала.
В клонировании, ядро клетки тела (например, клетки кожи) используется для замены ядра неоплодотворенной яйцеклетки. При активации эмбриона создается клон, который является двойником человека, от которого ядро было взято.
В зависимости от того, что мы хотим получить, клонирование называется «репродуктивным» или «терапевтическим», однако первоначальный метод получения клона был тем же самым.
Клонирования «Репродуктивное» будет происходить, если передать клон в тело женщины и позволить ему родиться. «Терапевтическое» клонирование может произойти, если целью было уничтожить его ради получения частей.
Части являются в центре эмбриона, который умрет, когда эти клетки будут извлечены. Клетки могут затем быть использованы в исследованиях по пересадке для тех, у кого есть определенные заболевания. Стволовые клетки являются универсальными клетками, которые производят видовые клетки, необходимые конкретному пациенту.
Есть, однако, и другие источники стволовых клеток, которые не связаны с эмбрионами, например, взрослого костного мозга, пуповины или сохранены при рождении.
Помимо успешных попыток клонирования различных видов животных, 20-й век ознаменовался также некоторыми из основных достижений в области генеалогии. Успешная расшифровка кода ДНК в 1968 году стала основным стимулом для очень стремительного развития клонирования человека.
В 1988 году геном человека, геном Homosapiens, хранящийся в 23 парах хромосом, был расшифрован. При существующем положении вещей наука прекрасно двигалась в направлении развития человеческого клона.
Серьезный удар пришел в виде Закона 2009 года о запрещении клонирования человека, который считает клонирование — незаконным, неэтичным и аморальным действием.
Против клонирования людей пришли мнения из научного сообщества, которые не были удовлетворены результатами клонирования животных, а также религиозные общины, которые считают клонирование человека вмешательством в человеческую жизнь и продолжение рода.
Это краткая история клонирования человека, охватывает период около 120 лет. По состоянию на 2009, когда клонирование человека стало считаться незаконной деятельностью в 23 странах.
Братство ученых и исследователей надеются, что клонирование человека будет легализовано в ближайшее время, после чего они смогут вернуться в свои лаборатории, и продолжить эксперименты, связанные с прежними исследованиями.
Основы. Клонирование целых животных.
Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности, и в этом - одно из существенных их отличий от клеток растений. Именно здесь главное препятствие для клонирования взрослых позвоночных животных. Методы клонирования целых животных до сих пор не доведены до стадии практического («промышленного») применения.
Наиболее удачными являются эксперименты по клонированию животных из эмбриональных недифференцированных клеток, не утративших тотипотентных свойств, однако есть положительные результаты и со зрелыми клетками.
Процесс клонирования протекает следующим образом - ядро соматической клетки пересаживают в лишенную ядра (энуклеированную) яйцеклетку и имплантируют ее в организм матери (если это животное, требующее вынашивания).
Энуклеация традиционно проводится микрохирургически или путем разрушения ядра ультрафиолетом, пересадка производится с помощью тонкой стеклянной пипетки или электрослиянием. В последнее время ученые из датского Института сельскохозяйственных наук разработали недорогую технологию клонирования, которая гораздо проще используемой ныне.
По новой технологии, яйцеклетки разрезаются пополам, и половинки с ядрами выбрасываются. Выбирается пара оставшихся пустых половинок, которые «склеиваются» в одну яйцеклетку после добавления нового ядра. Самая дорогая часть оборудования, которую использовали в этом эксперименте, -- машина для «сварки» клеток -- стоит всего лишь $3,5 тысячи. Технология может быть полностью автоматизирована и поставлена «на поток».
Успешность пересадки зависит от вида животного (амфибий клонируют успешнее, чем млекопитающих), методики пересадки и степени дифференцировки клетки-донора. Так, ещё Бриггс и Кинг в первых опытах на амфибиях установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других работах.
Гердон, использовавший в качестве доноров специализированные клетки эпителия, получил следующие результаты: в большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и только 1% развился в половозрелых особей. Однако, появление нескольких взрослых особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длительное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли быть использованы для пересадки. В последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.
Позже Гердон модифицировал эксперимент. Поскольку большинство реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется «серийной пересадкой» в отличие от «первичной пересадки»). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.
Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития, хотя и клоны дифференцированных клеток удавалось «доводить» до поздних стадий, особенно при использовании метода серийных пересадок.
Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.
У млекопитающих в качестве доноров используются малодифференцированные стволовые клетки или клетки ранних эмбрионов. Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) млекопитающих и пересаживать в них клеточные.
Опыты на мышах закончились полной неудачей - клоны гибли на стадии бластоцисты, что связано вероятно, с очень ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.
Для кроликов (Стик и Робл, 1989) был получен результат - 3,7% реконструированных яйцеклеток развились до нормальных животных.
Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.
Таким образом, была в целом решена проблема клонирования крупного рогатого скота. Например, в одном из экспериментов, 92 яйцеклетки из 463 развились до взрослых коров.
Позднее были получены клоны овец. В 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.
Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии G0 и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе (поэтому, видимо, нет строгой необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в этом нужны дополнительные данные).
Перспективным направлением в технологии клонирования животных является изучение генетических механизмов развития и дифференцировки клеток. Так, Рудольф Яниш из Whitehead Institute обнаружил, что 70-80 генов, которые обычно активизируются в развивающихся мышиных эмбрионах, у клонов оказываются либо неактивны, либо демонстрируют пониженную активность. Хотя непонятно, что же делают эти гены, однозначно установлено, что они включаются одновременно с еще одним геном, Oct4. Этот ген, в свою очередь, дает эмбрионам возможность создавать плюрипотентные клетки - то есть клетки, которые могут превратиться в любую ткань. Возможно, что часть активизирующихся одновременно с этим генов также задействуется в этом процессе. Теперь ученым предстоит выяснить, что заставляет эти гены молчать. В случае удачи наука сделает важный шаг вперед в разработке методологии клонирования.
Клонирование животных: применение и перспективы.
Клонирование в животноводстве.
Учитывая трудности в клонировании животных, говорить о широком практическом применении клонов в животноводстве рано. Однако перспективы у этого направления есть.
Клонирование ценных трансгенных животных может быстро и экономично обеспечить человечество новыми лекарственными препаратами, содержащимися в молоке, специально полученных для этого генноинженерными методами овец, коз или коров.
Появилось сообщение, что ученым из шотландской фирмы PPL Therapeutics, того самого, где была клонирована Долли, удалось получить успешные клоны овечек с измененной ДНК. Был внедрен ген, который добавляет в молоко овец фермент, используемый в современной фармакологии для лечения наследственной эмфиземы легких.
Клонирование высокопродуктивных домашних животных, в частности, молочных коров, может произвести буквально революцию в сельском хозяйстве, так как только этим методом можно создать не отдельные экземпляры, а целые стада элитных коров рекордисток. Это же относится к размножению выдающихся спортивных лошадей, ценных пушных зверей, сохранению редких и исчезающих животных в природных популяциях и т.д. Беспрецедентный по своему масштабу эксперимент по массовому клонированию крупного рогатого скота недавно начался в Китае. Как сообщает местная печать, в Синьцзян-Уйгурском автономном районе на северо-западе страны в этом году ожидается появление от 20 до 50 клонированных телят.
Проект ведется компанией «Цзиньню» и является крупнейшим в своем роде в мире. В нем также участвуют Австралия, Канада, США и Великобритания и ряд других стран. Китайские ученые полагают, что клонирование станет важным шагом в развитии животноводства и улучшении племенной работы.
Внедрение в практику методов межвидового переноса ядер может открыть невиданные перспективы для спасения находящихся на грани исчезновения видов животных. Было зафиксировано, что энуклеированные яйцеклетки крупного рогатого скота обеспечивают реализацию генетического материала донорских ядер из соматических клеток человека даже до более продвинутых эмбриональных стадий. Это является свидетельством того, что даже перенос ядер в ооциты далеких в эволюционном отношении видов обеспечивает их частичное репрограммирование. А может ли быть так, что трансплантация ядер в энуклеированные яйцеклетки близких видов приведет к получению полноценного здорового потомства?
Терапевтическое клонирование.
Новейшие технологии в области клонирования и создания эмбриональных стволовых клеток открывают огромные возможности для лечения многих заболеваний, связанных с дегенерацией определенных типов клеток, потерей функций тканей и целых органов. Около 16 млн. человек во всем мире страдают нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, свыше 120 млн. - диабетом и миллионы - артритами, СПИДом, инфарктами и другими заболеваниями, которые могут быть излечены с помощью применения клеточных трансплантатов.
По самым скромным подсчетам десятки наиболее распространенных заболеваний могут быть вылечены с внедрением клеточной терапии. Методы терапевтического клонирования позволяют избежать иммунного отторжения трансплантатов, поскольку ЭС клетки несут генетическую информацию донора ядер. Низкая эффективность трансплантации ядер не важна для осуществления клеточной терапии, так как для получения линии ЭС клеток достаточно всего одного или нескольких предимплантационных эмбрионов. Кроме того, сейчас рассматривается вопрос об использовании в качестве цитопластов энуклеированных яйцеклеток животных, например, крупного рогатого скота, которые поддерживают реализацию генетического материала ядра человеческой соматической клетки до стадии 5-дневного эмбриона.
Одной из перспективных сфер применения клонирования может оказаться ксенотрансплантация, то есть межвидовая трансплантация тканей и органов. Некоторыми компаниями ведется работа по созданию линии свиней с инактивированным геном альфа-1,3-галактозилтрансферазы. Этот ген кодирует фермент, участвующий в синтезе поверхностных антигенов клеток свиней, которые обусловливают немедленное отторжение трансплантатов у приматов. Технология клонирования с использованием генетически модифицированных культур клеток в качестве доноров ядер значительно упростит процесс создания такой линии.
Важный результат получен американскими учеными, которым удалось разработать метод выращивания новых костей в позвоночнике крыс.
В проведенных экспериментах ученые работали со стволовыми клетками. Они модифицировали их так, что стволовые клетки костного мозга стали экспрессировать белок ВМР-9, который способствует росту новых костей. Затем модифицированные клетки были инъецированы в одну сторону позвоночника крыс, в то время как в другую ученые инъецировали стволовые клетки, содержащие инактивированный ген.
Через 8 недель после начала эксперимента был зафиксирован рост костей лишь на той стороне спины, которая содержала модифицированные стволовые клетки. При этом вновь образованные кости выглядели абсолютно нормально.
Эта методика пока не была опробована на людях, однако исследователи полагают, что этот метод генной терапии, который включает в себя этап работы с клетками вне организма, является многообещающим для лечения заболеваний костей, а также показателем перспективности терапевтического клонирования вообще.
Не менее интересные результаты получили российские ученые. Им удалось клонировать из стволовых клеток человека кардиомиоциты.
Метод культуры клеток позволяет получить большое количество клеток - потомков одной первоначально взятой родительской клетки. Этот метод называется клонированием. Клон клеток - это совокупность клеток, имеющих происхождение от одной исходной клетки в результате митоза. В основе клонирования лежит фундаментальное свойство живого – способность к репликации, т.е. воссозданию, синтезу себе подобного. Такие клетки имеют совершенно идентичный геном.
В начале 70-х годов ХХ в. научились клонировать клетки. В течение 10 – 12 лет удавалось клонировать только опухолевые клетки, поскольку их собственным свойством является способность неограниченно делиться митозом. Г. Келлер и У. Мильштейн в 1974 – 1975 г. разработали методику получения гибридных клеток, одна из которых опухолевая (миелома), а вторая – нормальный лимфоцит. Получающиеся гибридные клетки имели какую-то часть хромосом нормального лимфоцита (другая часть хромосом выбрасывалась из клеток в течение первых делений, пока геном не стабилизировался) и какую-то часть от опухоли. Росли только клетки, унаследовавшие способность к неограниченному делению. Параллельно в них шел биосинтез тех или иных продуктов нормального лимфоцита, например, антител. Неограниченно делящиеся клетки клонировали, т.е. рассадили по одной (каждую в отдельную посуду) и получили клоны клеток. Такие клетки назвали гибридомами. Если гибридома синтезирует антитела, то их называют моноклональными. Такие антитела являются не только продуктами моноклона, но и чистыми препаратами одинаковых иммуноглобулинов. В конце 70-х годов научились выращивать in vitro и клонировать Т-лимфоциты. Это стало возможным только после открытия фактора роста для Т-лимфоцитов, позже названного интерлейкином-2 (IL-2).
Следующим методическим этапом исследования природы стало клонирование генов (молекулярное клонирование) – получение чистого клона гена и вслед за ним чистого клона молекул белка, кодируемого этим геном. Для того, чтобы клонировать конкретный ген, сначала надо узнать первичную последовательность нуклеотидов этого гена. Необходимо было также научиться искусственно синтезировать короткие отрезки ДНК (20 – 30 нуклеотидов) со строго заданной последовательностью нуклеотидов (олигонуклеотидов), используемых в качестве затравки (праймера) для синтеза длинных молекул ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Для клонирования ДНК ее вначале подвергают диссоциации (расплетанию) путем нагревания до 92 – 95 о С (термоденатурации). В результате данного метода можно получить миллионы копий исследуемого гена. Этот метод получил название полимеразная цепная реакция (ПЦР), впервые описанный в 1983 г. Керри Б. Мюллисом. За прошедшие годы этот метод получил широкое распространение во всем мире.
Получив столь «мощный» метод биосинтеза отдельных генов в чистом виде, стали «делать» трансгенных мышей и мышей с направленным разрушением определенного гена. Трансгенная мышь – это мышь, в геном которой введен посторонний экзоген. Чтобы сделать трансгенную мышь, необходимо иметь в качестве препарата чистую ДНК, строго воспроизводящую последовательность заданного экзогена. Самку мыши спаривают с самцом, после чего из самки быстро извлекают оплодотворенную яйцеклетку. Микроманипулятором в мужской пронуклеус ниъецируют ДНК экзогена. Такие яйцеклетки имплантируют в матку или яйцеводы другой подготовленной псевдобеременной самки и ждут от нее потомство. Опыт показывает, что примерно 25% новорожденных мышат несут экзоген (теперь уже трансген ) в своем геноме. В первом поколении мышей трансген находится в гетерозиготном состоянии. Таких мышей спаривают, и во втором поколении отбирают гомозигот по трансгену. Теперь они являются полноценными трансгенными мышами. С помощью трансгенных мышей были получены важные сведения о том, как осуществляется регуляция генов млекопитающих и каким образом некоторые гены (онкогены) обусловливают возникновение рака.
В последние годы получает развитие новая область медицины, так называемая биомедицина. Задачами этого направления медицины являются создание технологий сохранения, доставки, интеграции и функциональной актуализации в организме пациента средств молекулярной и клеточной терапии. Основой клеточной технологии является использование стволовых клеток. Разработана и реализуется программа исследований «Стволовые клетки и их использование в медицине». Поскольку стволовые клетки полипотентны, они могут развиваться в любом направлении - мышечных, нервных, эпителиальных и др. Стволовые клетки взрослого организма сохраняются в небольшом количестве, обеспечивая регенерационные способности тканей.
Различают несколько субклассов стволовых клеток:
Ранние эмбриональные стволовые клетки – клетки бластоцисты 1 –2 недели, тотипотентные;
Широко специализированные стволовые клетки – клетки гаструлы – нейрулы 3 – 4 нед., мультипотентные;
Ограниченно специализированные (фетальные) – клетки обновляющихся растущих тканей взрослого, составляют 1 – 2%, олигопотентные;
Фенотипически детерминированные – региональные стволовые клетки, из которых можно вырастить в культуре разные клетки; например, клетки костного мозга в культуре могут расти в разных направлениях.
Стволовые клетки используются для изучения:
Общих закономерностей эмбриогенеза человека;
Создания моделей болезней человека;
Закономерностей экспрессии генов в эмбриогенезе;
Разработки методов выделения и поддержания в культуре с сохранением их пролиферативных потенций;
Факторов клеточной дифференцировки;
Генотерапии;
Преодоления дефицита тканей для трансплантации.
Источниками стволовых клеток могут быть эмбрионы, искусственно выращенные эмбрионы, эмбриональные карциномы, премордиальные гаметоциты, клетки костного мозга, пуповинные и плацентарные клетки. Стволовые клетки используются для эмбрионального клонирования.
Если стволовые клетки ввести животному внутривенно, то они обнаруживаются в разных органах. Клонирование удается, если ввести ядро стволовой клетки, а не дифференцированной клетки взрослого организма. Такие клетки можно использовать для лечения болезней человека. Для этого их выделяют из организма (например, из ребра у добровольцев), обрабатывают в определенном направлении в культуре. Берут яйцеклетку у донора, ядро яйцеклетки микроманипулятором удаляют и вводят ядро обработанной соматической клетки. Затем клетка дифференцируется в определенном направлении (например, в нейральную) и ее вводят больному человеку. В Англии разработана методика клонирования эмбриональных клеток свиньи.
Стволовые клетки уже используются в медицине при ожогах. Таким способом выращивают кожу для трансплантации. Получены положительные результаты при лечении болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и др. Стволовые клетки могут быть материалом для выращивания тканей и органов для трансплантации. В настоящее время созданы банки стволовых пуповинных и плацентарных клеток. МЗ РФ разрешило клинические испытания клеточных систем в кардиологии и неврологии.
